Der lokale Lymphknoten-Test: Modifikationen und ihre Validierung

Prof. Dr. Hans-Werner Vohr, Bayer Healthcare AG, Toxikologie, Wuppertal

Der lokale Lymphknotentest (LLNA), wie er in der OECD-Richtlinie 429 beschrieben ist, basiert auf einer Messung der Proliferation durch radioaktive Markierung der Zellen (3H-Thymidineinbau). Andere Endpunkte für die Aktivierung der Lymphknotenzellen werden durch die Richtlinie zugelassen, sofern sie wissenschaftlich vernünftig belegt und zitiert sind und die Methode beschrieben wurde. In dem Vortrag wurden die Ergebnisse einer sogenannten Catch-Up-Validierung alternativer Endpunkte vorgestellt. An dieser Validierung haben insgesamt 9 Labors (5 der Industrie, 3 von Auftragsinstituten und eines einer Behörde) aus Europa teilgenommen. Die Ringstudie wurden beaufsichtigt durch die Schweizer Behörde für Heilmittel (Swissmedic) in Bern. Die Gewichte und Zellzahlen der die Ohren drainierenden Lymphknoten wurden anstelle der radioaktiven Methode zur Bestimmung der Proliferation eingesetzt. Zusätzlich wurde die akute Hautreaktion durch Bestimmung des Ohrgewichts gemessen (8mm ? Stanze). Dieser Parameter ist ein Maß für die irritierenden Eigenschaften einer Substanz. Die statistische Auswertung der Studie wurde durch einen unabhängigen Statistiker der Berner Universität durchgeführt.

Ähnlich wie bei den EC3-Werten der radioaktiven Methode, wurden auch für die Parameter des modifizierten LLNA vergleichbare Grenzwerte berechnet. Für die Studie wurde ein Auswerteschema festgelegt, welches die Kombination ermittelter Effekte berücksichtigt, um das sensibilisierende Potenzial zu ermitteln (Tabelle 1). Dieses Schema erwies sich als sehr große Hilfe, um das Potenzial der Testsubstanzen vernünftig zu bewerten.

Insgesamt wurden HCA sowie 11 geblindete Substanzen NMRI- (nur erste Runde der Validierung) und BALB/c-Mäusen appliziert. Die Ergebnisse wurden über den Koordinator an den Statistiker geschickt. Die Ergebnisse bestätigten die Sensitivität und Zuverlässigkeit der untersuchten Parameter. Ebenso bestätigen sie den Wert der Einbeziehung des Ohrgewichts (oder der Ohrdick) als Maß für die akute Hautreaktion, wodurch eine Abgrenzung von reinen Irritanzien zu sensibilisierenden Substanzen möglich wird. Außerdem wurden unterschiedliche Parameter gefunden, die auch einen Einfluß auf die Stärke der Reaktion haben. All diese Parameter müssen für eine exakte Kategorisierung von Substanzen gemäß ihrem relativen Potential berücksichtigt werden. Durch das o.a. Bewertungsschema gelang es allen Labors, die Irritanzien, die kein sensibilisierendes Potential besitzen, aus den Testsubstanzen herauszufinden (Tabelle 2).

Table 1: Assessment of results


A = Allergen
I = Irritant
A/I = Allergen with pronounced irritating potential or strong irritant
* = measured by ear swelling or ear weight

Table 2: Overall classification of test items A to L

(A): cell count index just near the "positive level" of 1.5 without being significant or exceeding it, i.e. between 1.4 and 1.5
nd: not done; two labs participated only in the second part of the validation
*1: one lab did the radioactive method in addition
*2: one lab used NMRI outbred mice in addition. In this case assessment of irritating properties were solely based on ear swelling data instead of ear weights.

[Both Tables are taken from G. Ehling et al., Toxicology, submitted 2004]

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